Η αρχή λειτουργίας μιας πιπέτας Παστέρ βασίζεται κυρίως στη ροή-οδηγούμενη από τη βαρύτητα και την τριχοειδή δράση, σε συνδυασμό με τον χειροκίνητο έλεγχο των διαφορών πίεσης αέρα για τη διευκόλυνση της αναρρόφησης και της μεταφοράς υγρών.
Χειροκίνητος έλεγχος αναρρόφησης: Ο χειριστής εφαρμόζει αναρρόφηση στο φαρδύ άκρο της πιπέτας-είτε από το στόμα είτε χρησιμοποιώντας έναν βοηθητικό λαστιχένιο λαμπτήρα-για να δημιουργήσει αρνητική πίεση εντός του σωλήνα, αντλώντας έτσι υγρό στο λεπτό άκρο.
Βαρύτητα-Διανομή βάσει βαρύτητας: Μόλις απελευθερωθεί η αναρρόφηση, το υγρό ρέει έξω φυσικά υπό την επίδραση της βαρύτητας. Η διανομή μπορεί επίσης να υποβοηθηθεί πιέζοντας απαλά το σώμα της πιπέτας ή γέρνοντας το δοχείο υποδοχής.
Αναπαραγωγιμότητα σταγονιδίων: Με τη βαθμονόμηση της αναλογίας "σταγόνων ανά χιλιοστόλιτρο", η πιπέτα επιτρέπει την κατά προσέγγιση ποσοτική μεταφορά, καθιστώντας την κατάλληλη για διαδικασίες που απαιτούν επαναληψιμότητα και όχι απόλυτη ακρίβεια.
Διασφάλιση στειρότητας: Πριν από τη χρήση, ένα βαμβακερό βύσμα μπορεί να εισαχθεί στο φαρδύ άκρο και να αποστειρωθεί για να αποφευχθεί η μικροβιακή μόλυνση κατά τον χειρισμό-μια πρακτική ιδιαίτερα κοινή σε μικροβιολογικά πειράματα.